分子剪刀：基因编辑文章解读（二） ——分子检测利器：Cas12 vs Cas13

2018年4月27日，Science同时发表了4篇关于CRISPR技术在临床诊断应用的文章，揭示了CRISPR在临床检测领域的广阔应用前景。张锋团队开发的SHERLOCK分子检测技术在上一篇文章中我们已经进行了介绍，而CRISPR领域另一顶级研究团队，来自美国加州大学伯克利分校的JenniferDoudna团队也发表题为《CRISPR-Cas12a target binding unleashesindiscriminate single-stranded DNase activity》的文章，作者发现typeV CRISPR-Cas12家族核酸酶在向导RNA介导下靶向目标双链DNA时，被激活了单链DNase活性，能够非特异、无差别地切割附近的单链DNA分子，基于Cas12家族的这种特性，作者开发了一种基于Cas12a的病毒分子诊断技术DNA Endonuclease TargetedCRISPR Trans Reporter（DETECTR），灵敏度达到attomolar级别，对临床HPV感染病人样本实现了快速、特异的病毒检测，为分子诊断领域拓展了一种简便快捷的手段。这篇文章篇幅似乎着重于Cas12a核酸酶作用机制的发现与探索上，在分子检测应用上没有展示太多数据，下面将对这篇文章进行介绍。

过去一段时间，CRISPR-Cas9家族蛋白因其精确的双链DNA切割能力已经被广泛开发应用到基因编辑领域中，Cas9的切割活性由2个催化结构域RuvC和HNH（序列与向导RNA互补）诱导。而另一家族的蛋白CRISPR-Cas12a（Cpf1）同样能催化RNA介导的双链DNA切割，不过Cas12a只有RuvC一个催化结构域，并且与Cas9不同的是，Cas12a能催化自身的向导RNA（crRNA）的成熟，然后识别一段富含T的PAM（protospacer adjacentmotif）序列，并在PAM一段距离外切割双链DNA产生不平整的5’，3’末端（图1，TS：Target Strand；NTS：Non-Target Strand）。

     图1

Cas12a的DNase活性吸引了基因编辑领域的兴趣，不过其对底物的特异性、对靶标DNA的切割机制仍未清楚。为研究Cas12a活化对底物的要求，作者测试了LbCas12a（来自毛螺旋菌属，ND2006）是否与多种CRISPR-Cas9蛋白类似，具有靶向切割单链DNA的能力。纯化的LbCas12a与SpCas9（来自酿脓链球菌）分别与对应的向导RNA组合，靶向一个环状、单链的M13噬菌体DNA，实验结果如图2B所示，LbCas12a并非进行特异的DNA切割，而是快速、完全地降解消化了M13单链DNA，同时催化功能失活的LbCas12a（D832A）没有展现出消化单链DNA的活性。在另一组实验中，搭配了另外一套crRNA和对应的单链DNA（即激活物，序列与M13基因组无同源性），LbCas12a同样能催化M13降解消化（图2C）。这些结果表明结合了靶标单链DNA的LbCas12a-crRNA复合物能有力地、非特异地反式切割单链DNA，催化单链DNA的降解（LbCas12a既能特异性识别靶标双链DNA，“顺式”精准剪切DNA位点，又有单链DNase活性，“反式”作用无差别、非特异地降解单链DNA）。

图2

LbCas12a这种反式切割活性是否只依赖于单链DNA靶标分子？作者分别使用单链DNA、双链DNA和单链RNA作为靶标，并使用一段带有荧光报告集团和淬灭基团的报告单链DNA，加入LbCas12a-crRNA

以检测其反式切割活性。如图3A所示，结果表明除了单链RNA，其余靶标都能激活LbCas12a，使其切割报告单链DNA，释放荧光信号。而不论是哪种类型靶标都不能使LbCas12a切割报告单链RNA（图3B），这表明LbCas12a是一种依赖靶标DNA激活的单链DNase。

图3

LbCas12a对靶标双链DNA的剪切活性依赖于靶标链（target strand，TS）的识别，如图4所示，对非靶标链（non-targetstrand，NTS）进行不同程度的截短（5nt，10nt，15nt，20nt）并没有影响TS的剪切，反之，对TS进行相同梯度的截短时则发现，NTS需要crRNA识别至少15nt的TS才能进行切割。

 图4

使用LbCas12a-crRNA靶向一个环状双链DNA质粒，然后分别加入序列非特异的双链DNA和单链DNA，如图5，作者发现单链DNA以类似Ruvc结构域切割的方式很快就被降解了，而非靶标双链DNA则一直保持完整未被切割，以上这些结果都表明LbCas12a只有结合了靶标双链DNA后才能发挥其“顺式”剪切双链DNA特异性位点和“反式”非特异切割单链DNA的特性。

图5

以上的实验结果同时表明了LbCas12a的顺式作用和反式作用的反应动力学基础是大不相同的，研究发现，LbCas12a的顺式剪切是single-turnover模式（酶反应动力学中，一种酶只针对一种底物，酶不断结合底物并反应直到底物浓度降到一定水平），而反式切割单链DNA则是multiple-turnover的模式，如图6B，图6C，Cas12a-crRNA复合物在剪切靶标双链DNA后仍然结合在双链DNA上，其远离PAM的剪切产物经由RuvC活性位点释放，释放的单链DNA作为新的底物又被Cas12a消化。

图6

经测定，使用单链DNA作为LbCas12a的激活物，LbCas12a催化单链DNA消化的速率为每秒250 turnovers（酶的转换数），催化效率（K_cat/K_m）为5.1×10⁸s^-1M^-1；使用双链DNA作为激活物，LbCas12a催化的速率为每秒1250 turnovers，催化效率（K_cat/K_m）为1.7×10⁹s^-1M^-1（图7），这种差别表明靶标双链DNA的NTS能协助Cas12a复合物保持结构稳定以使LbCas12a对单链DNA进行切割。

图7

单链DNA和双链DNA分别作为LbCas12a的激活物诱导Cas12a的反式切割活性时，Cas12a-crRNA复合物对靶标PAM序列的要求各不相同。双链DNA作为靶标时，PAM序列对于激活LbCas12a的反式切割活性至关重要，PAM序列本身或突变PAM邻近的序列（seedregion）的错配，将影响Cas12a的单链DNA反式切割活性（如图8，至少PAM和其邻近下游6个碱基内不能发生错配）；而对于单链DNA靶标，研究表明LbCas12a反式切割单链DNA并不依赖PAM序列（图8A）。

图8

type III的CRISPR-Csm/Cmr和type VI的CRISPR-Cas13a早先已被证实分别有靶标诱导激活的单链DNA酶和双链RNA酶活性，而作者发现type V家族的CRISPR效应蛋白也都具备反式切割单链DNA的活性，这可能是因为所有这些Cas12蛋白都包含一个RuvC核酸酶结构域。如图9，纯化的AsCas12a（来自氨基酸球菌属）、FnCas12a（来自土拉热弗朗西斯菌）及AaCas12b（来自酸土脂环芽孢杆菌）蛋白通过crRNA与靶标单链DNA激活物结合后，均能催化非特异单链DNA的降解，而type II家族的蛋白则不具备类似的活性。

图9

这种target binding→ssDNA cleavage的特性使得LbCas12a也具备了应用于DNA检测的潜力（靶向目标DNA然后报告，与Cas13可谓殊途同归了），作者选择了人类乳头瘤病毒（HPV）的两类高危亚型HPV16和HPV18作为检测目标，在临床上快速精准地检测HPV有助于发现HPV相关癌症，HPV16和HPV18常见于癌症前期的病灶中。作者在HPV基因组上一个TTTA PAM序列邻近选择了一段目标区域（HPV16和HPV18两种病毒亚型的这段区域序列只有6个bp的差异，图10A），使用对应的LbCas12a-crRNA分别靶向包含HPV16或HPV18的质粒，根据荧光报告单链DNA的信号判断检测的结果，结果当然是可以很好地区分两种病毒亚型啦（图10B，C）。

图10

相似的Cas蛋白，搭配等温扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification），针对性的名字DETECTR（DNA Endonuclease Targeted CRISPR TransReporter），一个新的分子检测平台应运而生，同样的，DETECTR检测灵敏度也达到了attomolar级（图11）。

图11

接下来DETECTR先是对人类细胞系样品的HPV进行检测，以验证对复杂模板的检测准确度。作者设计了2种LbCas12a-crRNA，能够靶向HPV16和HPV18的L1基因的高变异区V（图12A），然后分别检测HPV16感染的SiHa、HPV18感染的HeLa以及没有HPV的BJAB 3种细胞系，结果结合了等温扩增的DETECTR能够准确地检测到SiHa中的HPV16及HeLa中的HPV18（图12B）。在对真实的病人样本检测测试中，作者对25份病人肛拭子进行DNA粗提，然后使用DETECTR与DNA共同孵育1小时（图12C），检测结果与基于PCR技术的检测结果进行比较，PCR结果和DETECTR的信号有很好的相关性（HPV16：25/25符合率，HPV18：23/25符合率，其中一些样本包含多种HPV亚型，图12D，图13A,B），表明DETECTR可以作为一个新的分子诊断工具，在理论上能够以高准确度、高灵敏度地检测任何DNA序列。

图12

图13

在宿主细菌中，Cas12a的核酸酶功能有助于细菌抵御双链DNA和单链DNA噬菌体的攻击，同时也能通过靶向噬菌体复制或转录过程中临时产生的单链DNA从而抑制噬菌体的生理过程，在基因编辑方面，藉由结合靶标而激活的单链DNA切割活性能用于剪切replication forks（复制过程中的叉状结构）、R-loops（转录过程中产生的R型环状结构）和transcription bubbles（转录空泡结构）中短暂出现的单链DNA，以及用于同源介导双链DNA（homology-directedrepair，HDR）修复后单链DNA模板的消化清除。如今通过改造，Cas12a将成为分子诊断应用领域快速、灵敏、精确的检测利器。CRIPSR工具的发明无疑是近年分子生物学领域的壮举，但事实证明CRISPR绝不限于基因编辑的功能，同样一件事物换个角度去考量就能激发新的创造，而多彩的生物世界也一直等待着我们去探索更多的可能。

参考文献

1. Chen JS, Ma E, Harrington LB, et al.CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNaseactivity. Science. 2018;360(6387):436–439. doi:10.1126/science.aar6245

2.RobertA. Alberty and Gordon G. Hammes. The Journal of Physical Chemistry 1958 62 (2),154-159. DOI: 10.1021/j150560a005

3. Singh D, Mallon J, Poddar A, et al. Real-timeobservation of DNA target interrogation and product release by the RNA-guidedendonuclease CRISPR Cpf1 (Cas12a). ProcNatl Acad Sci USA. 2018;115(21):5444–5449. doi:10.1073/pnas.1718686115

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